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  • Caco-2細胞轉運實驗
    來源/作者:中國標準物質網  日期:2017-03-14

    人結腸癌細胞系Caco-2是用來研究藥物經腸吸收的常用模型。Caco-2細胞體外培養條件下可自發進行上皮樣分化,形成與小腸上皮細胞相同的微絨毛結構和緊密連接,形態學、標志酶的功能表達及滲透特征都與小腸柱狀上皮細胞很相似。在Caco-2細胞中,主要藥物轉運體如寡肽轉運體PEPTI,P-糖蛋白MDRI、多藥耐藥相關轉運蛋白MRP2和有機陰離子轉運多肽OATP2B1均有較高水平表達,能夠快速得到藥物的跨膜轉運屬性。此外,Caco-2細胞還表達一些腸道常見的糖苷酶、氨肽酶、酯酶和代謝酶,可考察存在代謝的情況下藥物的轉運情況。由Caco-2細胞獲得的藥物表觀滲透系數(Papp)與人小腸吸收具有良好的相關性,作為藥物吸收研究的一種快速篩選工具,Caco-2細胞模型已廣泛用于體外藥物分子小腸吸收的研究。

    Caco-2細胞模型是將Caco-2細胞接種于半透膜(多為聚碳酸酯多孔膜)上,待細胞生長分化為完整的細胞單層(一般21~24天),即可模擬人體腸道上皮吸收屏障,用于藥物通透性實驗(圖11-5)。

    近來研究發現,犬腎上皮細胞系MDCK Ⅱ和Caco-2細胞在許多藥物的轉運上具有很好的相關性,且其培養周期較短(3~5天)即可形成完整細胞單層,可以作為一種改良的Caco-2細胞模型,進行藥物的經腸吸收研究(圖11-6)。

    【材料】

    1.狀態良好的人結腸癌細胞。

    2.試劑胰蛋白酶、小牛血清、培養基(DMEM培養粉)、雙抗。乳酸脫氫酶檢測試劑盒、酚磺酞或熒光黃、D-Hanks液(每l000ml含NaCl 8.OOg,KC10.40g,NaH2P04·H20 0.06g, NaHC03 0.35g,酚磺酞0.02g) ,Hanks液(在D-Hanks液加MgS04·7H20 0.20g, CaCl2(無水)0. 14g,葡萄糖1.00g) ,75%乙醇。

    3.儀器凈化工作臺、C02孵箱、倒置顯微鏡、細胞計數板、電阻儀、酶標儀、TransweⅡ小室、HPLC/MS/MS(或核素標記檢測)。

    【方法】

    1. Caco-2細胞的培養復蘇細胞,加入DMEM培養液(內含10%小牛血清、青霉素100ug/ml、鏈霉素100 ug/ml )吹打數次,制成細胞懸液,計數。按(3~5)x104/ml密度接種于培養瓶或培養板中,置37℃,5% CO2的孵箱中培養,12小時后換液一次,以后每2天換液一次。細胞生長融合80%左右,即可傳代培養;顯微鏡觀察Caco-2細胞生長狀態良好,形態規則,分化完好,邊界清晰,即可進行試驗。MDCK II細胞培養方法相同。

    2.接種鋪板將狀態良好的細胞消化,吹打均勻,調節密度104~105/ml,吸取0.4ml細胞懸液接種于TransweⅡ小室,置于24孔板中,外孔加0.6ml培養液,內外孔液面大致等高。

    3.培養換液隔天換液。Caco-2細胞接種一周后每天換液。鑷子用乙醇棉擦拭消毒,過火冷卻后,夾出TransweⅡ小室,傾斜倒出培養液,用移液槍吸出24孔板中培養液后放回TransweⅡ小室,在小室內外輕柔加入適量D-Hanks液,沖洗殘留廢液;然后加入新鮮培養液,內孔0.4ml外孔0.6ml。

    4.檢測電阻 檢測前一天,電極紫外滅菌過夜。使用前電極用75%乙醇浸泡15分鐘,D-hanks液沖洗后37℃ Hanks液孵育30分鐘;同時,用37℃ Hanks液輕柔地清洗細胞單層3次以除去表面雜質,然后加入37℃ Hanks液內孔0.4ml外孔0.6m1置于培養箱中孵育30分鐘。

    然后,連接電極和機身,打開電阻儀電源,選擇電阻擋,按下測試鍵“test”顯示1000Ω(若選擇電壓擋則為1),表示狀態良好,可以使用。將電極置于TransweⅡ小室內外側,沒入Hanks液中,內短外長。最后,按下測量鍵“measure”,讀取電阻值。

    測量后棄掉Hanks液,更換新鮮培養液繼續培養或進行轉運實驗。電極用D-hanks液沖洗后靜置陰干。Caco-2細胞培養21天,TEER值可達到300Ω·cm2。MDCKⅡ細胞培養3~5天,TEER值可達到100~800Ω·cm2。

    5.檢測酚磺酞或熒光黃通透率以酚磺酞為例。用37℃ Hanks液輕柔地清洗細胞單層3次以除去表面雜質,然后加入37℃ Hanks液內孔0.4ml外孔0.6ml置于培蕎箱中孵育30分鐘。在小室內側(供藥側)加入酚磺酞(終濃度為5 mg/ml )并計時,設定時間點(0.5小時,1小時,2小時,3小時)在小室外側(受藥側)取Hanks液0.1 ml待測,然后補加相應體積的空白37℃ Hanks液;酶標儀檢測待測液吸光度,波長560nm;配制標準曲線,計算酚磺酞濃度。Caco-2細胞培養21天,TEER值達到300Ω·cm2后,酚磺酞(或熒光黃、甘露醇等)的漏出量應<5% , Papp≤107 cm/s,說明Caco-2細胞單層完整,可用于藥物透過研究。MDCK Ⅱ細胞培養3~5天,酚磺酞等標志物的漏出量和Papp即可達到此水平。

    6.通透性實驗為了模擬腸道環境,轉運實驗時,Caco-2細胞單層AP側緩沖液pH為6.0,BL側緩沖液pH為7.4,以下緩沖液pH均按照此要求配制。MDCK Ⅱ細胞單層無此要求。

    首先棄去TransweⅡ小室內外培養液,用37℃ Hanks液輕柔地清洗細胞表面3次以除去表面的雜質,然后加入37℃ Hanks液(內孔0.4ml,外孔0.6ml)置于37℃孵箱中孵育30分鐘。

    吸去緩沖溶液,在AP側(內孔)加入0.4ml含有受試藥物的Hanks液,作為供給液,在BL側(外孔)加入0.6m1空白的Hanks液作為接收液。此為吸收方向,A-B。

    7.外排實驗棄去TransweⅡ小室內外培養液,在BL(外孔)側加入0.6ml含有受試藥物的Hanks液,作為供給液,在AP側(內孔)加入0.4m1空白的Hanks液作為接收液。此為外排方向,B-A。

    8.雙向轉運實驗相同藥物同時進行通透性實驗和外排實驗,考察藥物的滲透方向率(PDR)。

    9.采樣和檢測將載有TransweⅡ小室的24孔板于恒溫搖床(37℃,50r/min)中溫孵,設定時間(0.5小時,1小時,2小時,3小時)從接受池取出50ul的接受液待測,然后補加相應體積的空白37℃ Hanks液。

    轉運實驗結束后,夾出TransweⅡ小室,用冰冷D-Hanks液徹底沖洗,置入新的24孔板中,向小室內加入200ul裂解液,恒溫搖床(37℃,50r/min)中裂解2小時。裂解液測定藥物濃度和蛋白含量。

    樣品加等體積乙腈沉淀蛋白,渦旋,離心,吸取上清液吹干,流動相復溶,渦旋,離心,吸取上清液進樣,質譜檢測。蛋白含量用BCA試劑盒測定。

    10.實驗過程中細胞單層完整性的監測在通透性試驗過程中,可以通過監測TEER值、緩沖液中乳酸脫氫酶活性的變化,確保整個過程中細胞單層的完整性;也可以在供給液中加入酚磺酞或熒光黃等標志物,同時測定標志物的通透率作為對照。

    [結果與分析]

    1. TEER值的計算TEER(Ω·cm2)=[測得電阻值-空白小室(未接觸細胞的小室,電阻在100~150Ω)電阻值]x0.6cm2聚碳酸酯多孔膜面積)

    Caco-2細胞單層TEER值隨培養天數遞增,15天后漸趨平緩,21天后可達200~600Ω·cm2。MDCK Ⅱ細胞培養3~5天,TEER值可達到l00Ω·cm2以上。

    2.轉運圖和攝取圖通過測定受藥側緩沖液中待測藥物的含量以及通透性實驗結束后細胞內蓄積的藥物含量,可以用轉運圖和攝取圖直觀的表示藥物的跨細胞轉運屬性。

    轉運圖的橫坐標為時間(min),縱坐標是單位面積的細胞單層轉運的藥物量(mol/Cm2)。由于藥物的跨膜轉運過程比較緩慢,所以在較長時間內轉運圖大致為直線上升趨勢(圖11-7)。

    攝取圖的縱坐標是單位重量的轉運體表達量(以細胞總蛋白量計算)攝取的藥物量(mol/mg protein)。攝取圖能反映藥物在細胞內的蓄積情況,從側面反映藥物的跨膜轉運情況。

    3.表觀滲透系數(PaPP,cm/s)的計算

    其中C0是受試藥物供給池藥物初始濃度,dQ/dt為接收池藥物出現的速率,A為聚碳脂膜的表面積。

    如果將轉運圖中橫坐標的單位以秒(s)計算,則dQ/dt即為轉運圖擬合直線的斜率。再除以A和Co,即PaPP。一般認為,吸收良好的藥物,其表觀滲透系數為PaPP>1×10-6 cm/s;而吸收較差的藥物,其PaPP<1×1O-7 cm/s。

    4.滲透方向率(PDR)的計算

    通過被動轉運的藥物,不管是細胞旁路還是跨細胞擴散,其PDR均為1左右;如果藥物的PDR顯著偏離1,則提示主動轉運的存在。例如二肽Gly-Sar,其腸道吸收經由寡肽轉運體PEPTI介導,由Caco-2細胞模型得到的PDR (A-B/B-A)為4.8 ;而P-gp的典型底物Rhodamine 123,其PDR(B-A/A-B)可達15左右。通過分析藥物跨膜轉運的PDR,可得到藥物跨膜轉運的作用靶點以及機制等信息。

    【注意事項】

    1.換液TransweⅡ小室內的培養液盡量倒出而不用移液槍,添加培養液時槍頭要貼小室側壁緩慢加液,任何情況下都要避免槍頭、鑷子及電極等物體與小室底部的多聚碳酸酯膜接觸,防止細胞單層和半透膜的破壞。

    2.確保的細胞單層完整性Caco-2細胞單層完整是細胞轉運模型建立成功的關鍵,可通過以下方法確保細胞單層的完整性。①鋪板前,用電子顯微鏡或光學倒置顯微鏡進行形態學檢查,確定Caco-2細胞狀態良好才能鋪板;②鋪板后,無法用顯微鏡觀察細胞形態,須用電阻儀定期測量單細胞層的電阻(TEER)值,TEER應隨培養天數而遞增,兩周后逐步穩定,如果TEER值突然下降,則說明細胞單層被破壞,不能繼續培養,用于藥物轉運實驗;③在轉運實驗進行前或進行過程中,應檢測標志物被動擴散的跨膜通量,通常用甘露醇,菊糖,熒光黃及酚磺酞等通過被動擴散轉運的小分子,其漏出量應小于5%,滿足Papp≤107 cm/s;④在轉運實驗開始和結束時,應檢測緩沖液中乳酸脫氫酶(LDH)的含量,如果細胞單層被破壞,會有大量LDH漏出。

    3.確保Caco-2細胞的功能分化堿性磷酸酶是小腸刷狀緣細胞的標志性酶,在單細胞層培養的不同階段應測定其活性,考察Caco-2細胞的分化情況。但是這種方法必須破壞細胞單層的生長,局限于方法學驗證的實驗中。藥物通透性實驗時,通常進行典型底物的跨膜轉運實驗,以驗證Caco-2細胞的功能分化。例如考察PEPT1的功能,可通過Gly-Sar的轉運情況反映;Rhodamine 123的轉運情況則反映Caco-2細胞P-gp的表達情況。

    4.無菌操作是Caco-2細胞轉運模型建立成功的必備條件由于Caco-2細胞須培養21天才能分化形成完整的細胞單層,所以在培養過程中一定要保證無菌操作,避免細胞污染。應用MDCK細胞模型,可將培養周期縮短至3~5天,大大減小了污染的可能性。

    【關鍵詞】糖苷酶 肽酶 聚碳酸酯 小牛血清 胰蛋白酶
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